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欢迎来到诺伟司的视觉协议系列 在此视频中,您将学习如何执行的各个阶段的荧光
免疫组化 使用此试验中最常用的方法。 在国际刑事法院的程序开始之前,我们将演示如何准备
盖玻片,细胞培养板中,然后由电镀我们的细胞。 我们首先进行酸处理新的盖玻片,在一摩尔的盐酸
24小时。 在仔细调迁酸和删除盖玻片后, 我们用蒸馏水洗每个, 然后最后用乙醇冲洗。
作为一个可选的步骤,你可以将盖玻片成胶层的机架 淹没它 一个0.1毫克/解决方案明胶或聚赖氨酸
五分钟。 在提供额外的细胞粘附到这些涂料的助手 盖玻片 确保在以后的洗涤步骤,他们不沾边。
治疗后移除胶层的机架和干盖玻片的文化 罩或加热烤箱。 干净干燥的盖玻片上,然后插入一个六以及各孔
培养板 并盖上盖子。 为了节省时间,大量的板可以提前准备的时间以备后用。 也可以在板下罩的紫外线消毒。
用干净的玻片准备在6孔板, 我们现在可以添加我们的细胞。 玄铁细胞中添加一个半百万个细胞,每孔的密度。
在孵化器中的细胞,然后培养过夜,直到他们达到您的首选 密度。 镀前一天,过夜培养的细胞,我们已经准备好
开始与国际刑事法院的程序。 在此ICC第一天,我们将修复, 通透, 涂抹并添加到细胞中的一次抗体。
开始吸固定的培养基,从每口井其次 细胞,用4%甲醛或10%福尔马林
在室温下进行10分钟。 吸干固定液,并用冰冷的PBS冲洗每个孔两次。 要小心,不要让干细胞在 或协议的任何进一步的步骤。
如果您感兴趣的蛋白质的抗原表位的细胞内表达, 细胞的通透性是必要的抗体来获得对
细胞。 虽然有许多不同的 通透剂,最常见的是0.1 - 0.5% 浓度 吐温20 或Triton-X100 在PBS中稀释。
Tween-20的用于定位于细胞质的表位 而用于透化细胞核和线粒体的Triton-X100。
与透化缓冲液10分钟,在室温下孵育井。 吸液透化缓冲液和洗涤三次,每次5分钟与
PBS麻线。 PBS捻线包含0.1%Tween-20的。 现在,我们将1小时,阻断非特异性结合位点,用封闭缓冲液
在室温下。 最好的封闭缓冲液是从主机中含有10%血清的PBST 种你的第二抗体。 但是, 也可以使用1%BSA的PBST。
准备通过在封闭缓冲液稀释的第一抗体 在指定的数据表中推荐的稀释。
多严格的稀释,有利于变数,可能是考虑到 在你的实验 为达到最好的结果。
孵育在4摄氏度过夜。 在我们的例子中, 因为我们正在使用的非共轭的主,我们将使用荧光
在第二天的共轭二次。 在两天我们的ICC程序 我们将增加我们的第二抗体, 执行可选的双标签和核标记步骤,
安装到幻灯片中,我们盖玻片 我们的抗体,用荧光显微镜获取图像。 首先,我们吸的主要抗体的解决方案后,洗涤细胞
用PBST洗涤三次,每次5分钟。 下一步准备floraform的标记的二抗,将绑定到主 抗体。 用二次封闭缓冲液稀释
在数据表上指定的推荐稀释 和孵育室温一小时。 覆盖板带箔防止敏感染料的降解。
吸干关闭细胞洗涤二次抗体溶液中,接着 用PBST三次 ,每次5分钟。 作为一个可选步骤的第二对可用于初级和次级
可视化的第二个抗原表位 它通过使用一个不同的地板。 此外,DNA结合染料,如DAPI 可以应用,而不需要进行二次抗体。
请参阅完整的书面诺伟司协议为进一步的说明,关于如何提高一倍, 三重标签。 的盖玻片现在准备将其安装在显微镜载玻片上。
取一个干净的幻灯片和分配一滴抗淬灭安装介质慢慢 拨号的移液管下的柱塞。 小心地取出盖玻片井,
让多余的洗滴 并把细胞面朝下到幻灯片上。 可以用来清除指甲油盖玻片密封,并防止它
干燥。 相片数现在可以被可视化,在显微镜下 或存储在摄氏-20度或4度 在黑暗的滑动箱或幻灯片书。
限制每张幻灯片的时间暴露在显微镜的光量助手 延长荧光信号 将防止光漂白。