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欢迎来到诺伟司的视觉协议系列。 在这段视频中,我们将学习如何执行各个阶段的蛋白质印迹
该试验中的最常用的方法。 我们可以开始准备的印迹之前,我们必须先准备好我们的样品裂解液。 在这个例子中,我们将准备从培养细胞中的一种蛋白质裂解液。
在这里,我们洗细胞两次,用冰冷的PBS和足够的裂解缓冲液 以覆盖细胞。 裂解缓冲液的选择在很大程度上取决于本地化
您感兴趣的蛋白。 我们刮去细胞和转移的细胞溶液的离心管 置于冰上。 为了溶解膜结合蛋白,我们将需要更强有力的
相比孤立的胞质蛋白提取洗涤剂。 在这个例子中,我们使用的是标准的RIPA缓冲,这是一种常见的缓冲区
为获得最大的蛋白产量。虽然从所有提取蛋白质 蜂窝本地化, 您的裂解缓冲液中的蛋白酶抑制剂,这是很重要的,包括将
防止退化您的样品。请务必使用新鲜配制蛋白酶 抑制剂,冰样品,并迅速开展工作。
我们虱子细胞由上下吹打 随后由在冰上孵育30分钟。 然后离心细胞成颗粒状。 弃沉淀,收集上清液。这是您的裂解。
确定您的样品裂解液中的总蛋白浓度 测试的溶胞产物与市售的蛋白质的一小部分
例如BCA定量测定。 这将帮助你在你的凝胶装入等量的蛋白质。 蛋白质印迹传统的预制减压和变性
条件。 这些条件将允许蛋白质是单独由它们的分子量 而不是他们的天然构象的形状或充电。
为了减少和变性样品, 稀释的每一个中的载样缓冲液,如传统的Laemmli缓冲液。 这个缓冲区含有β-巯基乙醇或DTT,以减少二硫键
脊之间的半胱氨酸, SDS协助变性提供一个净负蛋白质, 甘油陷入每口井的样品, 溴酚蓝可视化的裂解
一个标志性的缓冲区。 漩每个样品和孵育五分钟,以在95摄氏度 完全变性的蛋白质。现在,您可以加载您的样品放入一个
SDS页凝胶。