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电转的蛋白质膜后,我们会阻止 印迹, 应用主我们兴趣蛋白质的,然后二次抗体的特异性的抗体
这将识别第一抗体。 开始通过从磁带盒中取出膜,和漂洗三次 水。 作为一个可选步骤,我们可以验证成功转移的蛋白质
染色膜,丽春红。 孵育丽春红膜五分钟,用水洗涤,直至 的带是明确的。 验证后的印迹可以然后被继续用染色
水或TBS捻线直至染料完全除去。 我们需要阻止已经不含有蛋白质印迹的各个领域。
这将防止非特异性结合的抗体,并降低整体 背景信号。 普通的封闭缓冲液包括5%无脂干牛奶的测定
在TBS缠绕解决方案。 但是不要用牛奶,因为它可以磷酸化特异性抗体,探测 其内源性磷酸化,导致高背景铯。
一小时,在室温下孵育膜用封闭溶液 轻微的搅拌下。 弃去封闭液和洗五分钟,用TBS捻线。
我们现在已经准备好加入我们的抗体。在稀释的第一抗体 封闭缓冲液的浓度在数据表上推荐。
在摄氏4度,轻轻摇动孵育过夜。 推荐使用可选的步骤是,还可以使用加载抗体阳性对照
这允许用户验证等量的总蛋白被加载到每个 和助手消除任何不确定性的故障排除
Western Blot检测程序。第二天,倾出初级抗体和 大量的TBS麻线和剧烈搅拌洗膜 5次,每次5分钟。
这些严格的清洗除去非特异性是非常重要的 背景信号。 洗涤后,用封闭液稀释二次抗体和
在室温下孵育一小时的膜,在此浓度 建议在数据表中。 在我们的例子中,其次是共轭HRP后
检测。 倒出大量的TBS缠绕的膜,洗二次 剧烈搅拌5次,每次5分钟。现在,您准备好了
检测阶段。