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镀前一天,过夜培养的细胞,我们已经准备好 开始与国际刑事法院的程序。 在此ICC第一天,我们将修复,
通透, 涂抹并添加到细胞中的一次抗体。 开始吸固定的培养基,从每口井其次
细胞,用4%甲醛或10%福尔马林 在室温下进行10分钟。 吸干固定液,并用冰冷的PBS冲洗每个孔两次。
要小心,不要让干细胞在 或协议的任何进一步的步骤。 如果您感兴趣的蛋白质的抗原表位的细胞内表达,
细胞的通透性是必要的抗体来获得对 细胞。 虽然有许多不同的透化剂,最常见的
0.1 - 0.5%浓度的吐温20或 的Triton-X100 在PBS中稀释。 Tween-20的用于定位于细胞质的表位
而用于透化细胞核和线粒体的Triton-X100。 与透化缓冲液10分钟,在室温下孵育井。
5分钟吸通透缓冲和洗三次 每个PBS缠绕。 PBS捻线包含0.1%Tween-20的。 现在,我们将1小时,阻断非特异性结合位点,用封闭缓冲液
在室温下。 最好的封闭缓冲液PBST中含有10%血清 你的第二抗体的宿主物种。 然而,也可以使用1%BSA的PBST。
准备通过在封闭缓冲液中稀释,在推荐的第一抗体 在数据表上指定的稀释。 多严格的稀释,有利于考虑到的变量
可以是不同的测定并 为实现最佳的效果。 孵育在4摄氏度过夜。 在我们的例子中,因为我们使用的非共轭的主,我们将使用荧光
在第二天的共轭二次。