Tip:
Highlight text to annotate it
X
欢迎来到诺伟司的视觉协议系列。 在这段视频中,我们将学习如何执行各个阶段的蛋白质印迹
该试验中的最常用的方法。 我们可以开始准备的印迹之前,我们必须先准备好我们的样品裂解液。 在这个例子中,我们将准备从培养细胞中的一种蛋白质裂解液。
这里 用冰冷的PBS洗涤细胞两次 和足够的裂解缓冲液中,以覆盖细胞。 裂解缓冲液的选择很大程度上取决于您
兴趣蛋白质的选择。 我们刮去细胞和转移的细胞溶液的离心管 置于冰上。 为了溶解膜结合蛋白,我们将需要更强有力的
相比孤立的胞质蛋白提取洗涤剂。 在这个例子中 我们使用的是标准的RIPA缓冲液,
这是一个常见的缓冲区,为获得最大的蛋白产量。虽然提取 蛋白从细胞的本地化, 您的裂解缓冲液中的蛋白酶抑制剂,这是很重要的,包括将
防止退化您的样品。请务必使用新鲜配制蛋白酶 抑制剂,冰样品,并迅速开展工作。
我们虱子细胞由上下吹打 随后在冰上温育30分钟。 然后离心细胞成颗粒状。 弃沉淀,收集上清液。这是您的裂解。
确定你的蛋白溶胞产物中的总浓度 测试您的溶胞产物的一小部分的
用市售的蛋白定量测定 例如BCA。 这将帮助你在你的凝胶装入等量的蛋白质。
蛋白质印迹通常预制减压和变性 条件。这些条件允许的蛋白质是他们分开
分子量 而不是他们的天然构象的形状或充电。 为了减少和变性样品, 稀释的每一个中的载样缓冲液,如传统的Laemmli缓冲液。
这个缓冲区含有β-巯基乙醇或DTT,以减少二硫键脊 之间的半胱氨酸, SDS协助净负蛋白质变性,
甘油陷入每口井的样品, 溴酚蓝可视化的裂解和标志性的缓冲。 漩在摄氏95度的温度下五分钟,以每个样品
完全变性的蛋白质。现在,您可以加载您的样本 进入的SDS页凝胶。 对于这一步,我们将在我们的样本中分离的单个蛋白
裂解液 根据其分子量 使用的正极,以吸引带负电荷的蛋白质。 要做到这一点 我们我们事先准备的蛋白样品装载到市售的
聚丙烯酰胺凝胶。 可在固定百分比或丙烯酰胺梯度凝胶。 凝胶的比例更高的丙烯酰胺的小
百分比。 因此,较高的百分比凝胶是更好的低量的蛋白质,低比例 凝胶是更好的大重量的蛋白质和梯度凝胶可用于
各种规模的蛋白质 由于其不同的孔径范围内。 准备你的凝胶通过插入到电泳装置和
填充的缓冲区,适合您的凝胶化学与运行。 运行缓冲液冲洗凝胶孔中,并添加缓冲液的
室。 将您的样品入井。 如果您不确定的负载量, 10-30微克的总蛋白是一个建议的起点
以及整个装载的样品量。 您还需要保留至少一个预染分子量 阶梯。 梯子将允许你监控蛋白质分离
电泳,随后确认样品中的蛋白质重量 以后的分析。 关闭电泳单元,并把它连接到一个电源。大多数单位
通常运行45-60分钟,在200伏的 或直到上样缓冲液到达凝胶底部。 在此期间,在每个样品中的带负电荷的蛋白质将转向
正电荷的电极,使他们的方式,通过聚丙烯酰胺 凝胶基质中。 在这一步中,我们将转移出来的凝胶分离蛋白
并进入的固体膜或印迹。 这是根据作为前一步骤相同的主要 电场被充电到移除负蛋白 向正极。
在潮湿或半干旱的条件下可发生转移。 在这里,我们将展示传统的湿法转移方法。开始拆除
从它的磁带盒的凝胶 切割顶端部含有各孔。 缺口左上角到指定的凝胶方向。
浮动转移缓冲溶液中,转移而准备的三明治。 为了使传输三明治 您将需要的磁带,
海绵,滤纸 在凝胶 和您所选择的PVDF或nitrocellulous的膜。 PVDF必须首先通过在乙醇中浸泡膜被激活
两分钟。但以外的PVDF或选择nitrocellulous的这 膜是一种个人的喜好。 缺口左上角表明印迹方向
孵育膜在转移缓冲液10分钟。 通过将以下组件创建一个堆栈 从黑色负极阴极红色正极负极:
海绵, 滤纸, 膜, (小心不要将凝胶或膜用裸手触摸和使用 干净的镊子或小铲。 触摸膜可以在任何阶段污染的印迹,并导致
过高的背景信号。 ) 滤纸 和海绵。 每一层轻轻地推出任何气泡可能是使用一个干净的滚子
目前 因为气泡会抑制蛋白质高效传输。 锁定磁带,并将其放置在设备冷
转印缓冲液 确保被正确地定位在盒从负到正。 为了防止热量堆积,这是有利于用冷转移
装在该装置中 装置或在冷室中放置在腔室的底部与飞旋酒吧。 关闭的腔室,并连接到一个电源。
根据制造商的指示,这是执行传输 通常为100伏为30至120分钟。 电转的蛋白质膜后,我们将
现在阻止印迹, 应用主我们兴趣蛋白质的特异性的抗体,然后一个辅助 将识别第一抗体的抗体,该抗体。
开始通过从磁带盒中取出膜,并在水中漂洗三次。 作为一个可选步骤,我们可以验证成功转移的蛋白质
染色膜,丽春红。 孵育丽春红膜五分钟,用水洗涤,直至 的带是明确的。 经核查 通过继续用水冲洗染色然后印迹可以被取消
或TBS麻线 直到染料被完全除去。 我们需要阻止所有不含有蛋白质印迹。
这将防止非特异性结合的抗体,并降低整体 背景信号。 普通的封闭缓冲液包括5%无脂干牛奶的测定
在TBS缠绕解决方案。 但是不要用牛奶,探测与磷酸化特异性抗体 ,因为它可以导致背景很高,其内源性磷酸化,铯。
孵育膜用封闭液在室温1小时 温度 轻微的搅拌下。 弃去封闭液和洗五分钟,用TBS捻线。
我们现在已经准备好加入我们的抗体。在稀释的第一抗体 封闭缓冲液的浓度在数据表上推荐。
在摄氏4度,轻轻摇动孵育过夜。 推荐使用的是可选的步骤也使用阳性对照抗体
这允许用户验证等量的总蛋白被装入 每口井和助手,消除任何故障排除
Western Blot检测过程的不确定性。 第二天, 倾析关闭初级抗体和洗膜与大量
TBS麻线和剧烈搅拌 5次,每次5分钟。 这些严格的清洗除去非特异性是非常重要的
背景信号。 洗涤后,用封闭液稀释二次抗体,孵育 浓度的膜在室温下在一小时 建议在数据表中。
在我们的例子中,其次是共轭HRP后 检测。 倒出大量的TBS缠绕的膜,洗二次
剧烈搅拌5次,每次5分钟。 您现在已经准备好检测阶段。 在这最后的阶段,我们将使用最常用的演示信号的发展,
最敏感,最便宜的检测方法,电化学 (或ECL)反应。 该方法利用HRP酶,
是共轭到次级催化ECL反应,并产生 光。 然后聚集到一盏灯的X光胶片和发展
一个专门的摄像头足够敏感的援助或数字化 此应用程序。 我们在一个以1:1的比例混合等份ECL试剂开始
根据制造商的说明。 我们将孵化膜,不加搅拌3-5分钟。 孵化后,倾出ECL混合物和使用实验室擦来擦去多余的
溶液从膜的角落。 如片保护,以防止在一个透明的塑料保鲜膜放置 干燥。不要让膜完全干燥。 我们现在可以使用一个辊,推动任何气泡或任何多余的解决方案。
立即开发的膜。 胶卷和相机系统可让您手动调整曝光时间 为了确保一个完美的画面Western Blot检测。
相对的带的密度可以与市售现在将量化 软件。 。由带的大小进行比较,以适当的分子量,也可以验证
分子量阶梯。